Princípios de cromatografia a líquido (HPLC)
O princípio básico da cromatografia é a separação de misturas, no qual as substâncias a serem separadas são distribuídas entre duas fases: uma fase estacionária e uma fase móvel.
A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) ou em inglês, High Performance Liquid Chromatography (HPLC), tem sido amplamente utilizada na análise de separação, identificação e quantificação de compostos ativos.
Os principais componentes de um HPLC são:
- Reservatório de fase móvel: Garrafas com solventes utilizados para “transportar” a amostra
- Injetor: Dispositivo que permite a introdução da amostra no sistema
- Bomba: Responsável por movimentar a fase móvel e a amostra por todo o sistema
- Coluna cromatográfica: É um dispositivo preenchido com fase estacionária
- Detector: Responsável por identificar os tempos de retenção das substâncias analisadas
Como se faz a identificação de um composto por HPLC?
O tempo de retenção varia de acordo com as interações das substâncias presentes na amostra com as fases estacionária e móvel, por isso, cada composto será eliminado da coluna e identificado pelo detector em um tempo diferente, gerando um pico cromatográfico.
A análise dos diferentes picos nos permite identificar e quantificar as substâncias presentes na amostra.
Os principais detectores utilizados em cromatografia de fase líquida, são:
- Ultravioleta-Visível (UV-VIS / DAD)
- Fluorescência (FL)
- Índice de Refração (RI)
- Detector ELSD e C.A.D.
- Espectrometria de Massas (MS)
Detector por Ultravioleta-Visível (UV-VIS) e Arranjo de Diodos (DAD)
Os detectores UV-VIS são os mais utilizados em HPLC, pois apresentam o mais baixo custo, aceitam o uso de gradiente e geralmente não são afetados por pequenas mudanças de fluxo e temperatura.
Ele consiste em um fotômetro que mede a absorção de luz dos compostos, em comprimento de onda pré-programado, compreendido entre as regiões visível e ultravioleta.
O princípio da detecção por UV-VIS pode ser definido através da concentração do analito relacionada à fração da luz transmitida pela célula do detector pela lei de Beer-Lambert.
As configurações mais comuns dos detectores de UV-VIS são:
- Detector de comprimento de onda fixo
- Detector de comprimento de onda variável
- Detector de arranjo de diodos (DAD – Diode Array Detector).
O detector DAD permite determinar os espectros das substâncias presentes da amostra no eluente com diferentes comprimentos de onda durante a análise cromatográfica.
A detecção por UV-VIS é geralmente aplicada em compostos cujas moléculas apresentem características para a absorção na região de UV-VIS.
Principais aplicações: determinação de compostos ativos e contaminantes em medicamentos, alimentos, amostras ambientais, química fina, etc.
Detector por Fluorescência (FL)
Os detectores por fluorescência (FL) são muito sensíveis, seletivos e com alta especificidade. A sensibilidade deste tipo de detector pode ser de 10 a 1000 vezes maiores que os detectores UV-VIS.
O detector de fluorescência consiste em uma lâmpada de excitação seguida por um filtro ou uma rede de difração. A luz gerada por esta lâmpada incide sobre a célula da amostra excitando a mesma.
Ao retornar ao estado fundamental o composto emite um feixe de luz que é dirigido a um filtro ou monocromador, que seleciona o comprimento de onda emitido, fazendo-o incidir no fotodetector.
Aplica-se em análises de HPAs, aminoácidos, micotoxinas, esteroides, vitaminas, aditivos e corantes alimentares.
Detector por Índice de Refração (RI)
Confesso que o detector que me chama mais atenção, por conta de suas peculiaridades (que, infelizmente, não há espaço para escrever aqui) é o detector por Índice de Refração (RI).
Também chamado de refratômetro diferencial, este sistema é conhecido como detector universal por apresentar respostas para qualquer espécie de amostra.
Como funciona o Detector de RI?
A análise baseia-se na mudança do índice de refração do eluente por causa dos componentes da amostra. Quanto maior a diferença do índice de refração entre a fase móvel e o componente da amostra, mais intenso é o sinal.
Este detector possui como principais características:
- Versatilidade, pois detecta todos os solutos
- Moderada sensibilidade (é até 1000 vezes menos sensível que o UV/VIS)
- Sensível a qualquer mudança de temperatura alterando sua resposta
- Fácil de operar
- É pouco recomendável o uso de gradiente
- Não é destrutivo
Os detectores de índice de refração são empregados quando outros disponíveis não respondem aos compostos de interesse e a sensibilidade não for muito importante, como por exemplo, em separações preparativas e em análises de macromoléculas em cromatografia de exclusão por tamanho.
Detector ELSD e CAD
Um Detector de Dispersão de Luz por Evaporação (Light Scattering – ELSD) é comumente usado para análise de compostos nos quais a detecção de UV-VIS pode ser uma restrição, como: açúcares, antivirais, antibióticos, lipídios, fosfolipídios, terpenóides e álcoois.
O ELSD é muito parecido com o Detector de Aerosol Carregado (CAD) e os dois modelos se enquadram na categoria de detectores de uso geral, semelhantes aos detectores de índice de refração (IR).
Como funcionam os detectores de dispersão de luz?
Detectores de dispersão de luz analisam o solvente após eluição de HPLC.
À medida que o eluente passa pelo sistema HPLC, ele é misturado com um gás inerte de transporte e forçado através de um nebulizador, que separa o líquido em minúsculas gotas aerossolizadas.
Estas gotículas passam então para um tubo de drift aquecido, onde o solvente da fase móvel é evaporado. À medida que a fase móvel se evapora, as gotículas se tornam menores até que tudo o que resta são partículas minúsculas de analito seco.
Estas partículas são empurradas através do tubo de drift pelo gás de arraste para a região de detecção. Nesta região, um feixe de luz atravessa a coluna de analito e a dispersão da luz é medida por um tubo fotomultiplicador.
Detector por Espectrometria de Massas (MS)
Como funciona um detector por espectrometria de massas?
Vejamos…
Quantos compostos podemos ter com massa molecular 122?
Resposta: Vários!
Eis alguns exemplos: C4H4N5, C4H10O4, C6H6N2O, …
O interessante é que os compostos quando fragmentados, dificilmente se “quebram” em moléculas de mesmo tamanho. Um composto A de massa 122, pode se quebrar em duas moléculas menores, uma de massa 70 e outra de massa 52. Um composto B, de mesma massa, pode se quebrar em duas moléculas menores, uma de massa 100 e outra de massa 22, etc.
De forma bastante resumida, um sistema de espectrometria de massas consegue identificar um composto utilizando-se desta peculiaridade da fragmentação.
O composto Benzamida, por exemplo, de massa 121 sofre a primeira fragmentação e se “quebra” em duas moléculas menores mais abundantes, uma de massa 105 e outra de massa 44.
Em seguida, a molécula de massa 105 é novamente fragmentada e nos leva a identificação do composto de massa 77 (benzeno), que é nosso composto de interesse.
Utilizando-se da técnica de fragmentação de moléculas via MS, dificilmente você obterá um falso positivo (identificação de um composto sem ele estar presente na amostra) ou um falso negativo (não identificação do composto, mesmo ele estando presente na amostra).
Finalizando…
Como vimos, existem vários tipos de detectores e a escolha dependerá das características dos compostos de interesse.
Um bom detector de HPLC deve possuir as seguintes características:
- Alta sensibilidade, seletividade, linearidade
- Ser pouco sensível às variações de temperatura e fluxo
- Ser preciso e apresentar boa reprodutibilidade.
Espero que as informações lhes sejam úteis!
GILSON SIQUEIRA
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